Opsporingstegnologie van A2 β-kaseïen in suiwelprodukte

In onlangse jare is suiwelprodukte wat beweer dat hulle A2 β-kaseïen (afgekort as CN) bevat (verwys na as A2-suiwelprodukte, soos "A2-melk" en "A2-melkpoeier") aansienlik hoër geprys as vergelykbare standaardprodukte. Die teenwoordigheid van A2 β-CN het 'n belangrike kwaliteitsaanwyser vir suiwelprodukte geword. Geen land het egter tans produkstandaarde vir A2-suiwel nie, wat 'n regulatoriese uitdaging inhou.

Basiese samestelling van melk

Suiwelprodukte sluit vloeibare melk in, soos koeimelk, bokmelk en kameelmelk, en hul produkte. Suiwelprodukte verwys na verskeie vloeibare of vaste voedselsoorte wat hoofsaaklik van melk gemaak word deur prosesse soos verhitting, droogmaak, vries of fermentasie. Omdat melk 'n onontbeerlike voedsame drankie in ons daaglikse lewens geword het, sal die basiese samestelling van melkbestanddele hier verduidelik word.

Melk bestaan ​​uit water en droë materiaal. Droë materiaal sluit vet, proteïen, laktose, anorganiese soute, ens. in. Die verhoudings van elke komponent is gewoonlik soos volg:

• Water: 85.5%-89.5% (gemiddeld 87.5%);
• Vet: 2.5%-6.0% (gemiddeld 3.9%);
• Proteïen: 2.9%-5.0% (gemiddeld 3.4%);
• Laktose: 3.6%-5.5% (gemiddeld 4.8%);
• Anorganiese soute: 0.6%-0.9% (gemiddeld 0.8%);

Ander: Spoorelemente, Vitamiene, Cholesterol, ens.

Die totale melkvaste stowwe in gewone melk, of die "droë materiaal" nadat die waterinhoud verwyder is, verteenwoordig die voedingswaarde van melk. Die inhoud daarvan is gewoonlik tussen 10.5% en 14.5%, en kan bereken word met behulp van die Fleschmann-formule:
T = 0.25L+1.2F±K

Waar:

• T - totale melkvastestowwe (%);
• L - melkdigtheid (g/mL);
• F - vet (%);
• K - koëffisiënt (bepaal op grond van plaaslike toetsing; die standaard in China is 0.14).
  
  Dit is die moeite werd om daarop te let dat die proteïene in koei- en alpakkasmelk volledige proteïene is, wat alle essensiële aminosure bevat. In vergelyking met borsmelk het koei se melk 'n laer laktose- en oligosakkariedinhoud, maar 'n hoër kaseïen- en mineraalinhoud. Koei se melk het ook 'n baie hoër proteïeninhoud as borsmelk (sien Figuur 1).
  
  
  Oorsprong en eienskappe van A2-tipe β-CN
  
  Melkproteïene bestaan ​​hoofsaaklik uit weiproteïen en sianokobalamien. In borsmelk maak sianokobalamien ongeveer 50% van die proteïeninhoud uit, terwyl dit in koeimelk 80% kan bereik. GB 31638-2016 Nasionale Voedselveiligheidstandaard - Kaseïen definieer sianokobalamien as "'n produk verkry van melk en/of suiwelprodukte deur suur-, ensiematiese of membraanskeidingsprosesse, bestaande uit 'n mengsel van α, β, κ en γ, en hul isovorme." Borsmelkproteïen bestaan ​​hoofsaaklik uit β-sianokobalamien, 'n bron van aminosure, fosfor en kalsium vir babas en jong kinders, en vorm wrongel in die maag vir vertering. β-sianokobalamien is die oorheersende kaseïen, wat ongeveer 30%-40% van kaseïen uitmaak. Daar is 12 natuurlik voorkomende variante: A1, A2, A3, B, C, D, E, F, G, H1H2, en I, met A1 en A2 as die algemeenste. β-sianokobalamien en sy ensiematiese hidroliseprodukte het verskeie voedingsvoordele, insluitend die bevordering van kalsium- en sinkabsorpsie. Terwyl A1 die oorheersende β-sianokobalamien in gewone koeimelk is, is A2 ook teenwoordig in bok- en kameelmelk. 'n Glas melk van 250 ml bevat ongeveer 2 g tot 3 g β-CN (sien Figuur 2).

Navorsing dui daarop dat die aminosuurvolgorde van A2β-CN die mees primitiewe is. Die A1β-CN-variant wat tans in beesbevolkings voorkom, is 'n mutasie van prolien (Pro) na histidien (His) by posisie 67 van die A2-aminosuurvolgorde (sien Figuur 3). A1β-CN kan ensiematies in mense gehidroliseer word om 7-aminosuur β-kasomorfien (BCM-7) te produseer, 'n melk-afgeleide bioaktiewe opioïedpeptied wat endogene opioïedreseptore aktiveer om fisiologiese reaksies te produseer. In teenstelling hiermee hidroliseer A2β-CN selde na endogene opioïedpeptiede.

Epidemiologiese studies het BCM-7 gekoppel aan sekere siektes, insluitend 'n verhoogde risiko van tipe 1-diabetes, hartsiektes, skielike neonatale dood, respiratoriese disfunksie, gastroïntestinale afwykings en neurologiese afwykings soos outisme en skisofrenie. Die omvang van hierdie assosiasie moet egter geverifieer word.

Deteksietegnologie van A2-tipe β-CN in suiwelprodukte

Tans is daar geen produkstandaarde en toetsmetodestandaarde vir A2-melkprodukte tuis en in die buiteland nie. Die relevante metodestandaarde en -metodes wat in die literatuur gerapporteer word, kan β-CN kwalitatief en kwantitatief analiseer.

01 Bestaande relevante metodestandaarde

(1) BJS 201915 Bepaling van kaseïeninhoud in melkbevattende drankies en hul melkgrondstowwe. Die beginsel is om isoëlektriese presipitasie te gebruik om die kaseïen in die monsteroplossing weer op te los, dit ensiematies met tripsin te hidroliseer, 'n isotoop interne standaard by te voeg, dit met 'n C18-waterkolom te skei en dit te kwantifiseer deur LC-MSMS en interne standaardmetode. Die inhoud van vier CN-subtipes: αs1-CN, αs2-CN, β-CN en κ-CN kan bepaal word.

(2) T/CNHFA 003-2022 Kwalitatiewe bepaling van beeskaseïenkomponente in melk en suiwelprodukte. Kapillêre gelelektroforese word gebruik.

02 Analitiese metodes wat in die literatuur gerapporteer is

Dit kan in twee kategorieë opgesom word: een is gebaseer op die navorsingsobjek en analiseer onderskeidelik die koeigenotipe en die finale produk. Die ander word verdeel in kwalitatiewe analise en kwantitatiewe bepaling gebaseer op die beginsel van die analisemetode.

(1) Gebaseer op die navorsingsobjek

Teikenstelling van die koei-genotipe: Die hoofdoel is om A2-beeskuddes te selekteer en te teel en melkbronne te bestuur. Byvoorbeeld, PCR-restriksiefragmentpolimorfisme (RFLP), alleel-spesifieke PCR (AS-PCR), TaqMan-sondemetode en rhAmp-tegnologie kan gebruik word om A1-koeie, A1A2-koeie en A2-koeie te onderskei, maar dit is moeilik om die kruiskontaminasie of vervalsing wat in die verwerkingsproses en produkte kan voorkom, te toesig of op te spoor. Byvoorbeeld, Nguyen et al. (Food Chemistry, 2019, https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.125532) het ammoniumasetaatpresipitasie van CN, rekonstitusie in ureumbuffer, skeiding op 'n Agilent Poroshell 120 EC18-kolom en analise deur UHPLC-HRMS (Q-Orbitrap) gebruik. Hierdie metode verskaf molekulêre gewigsinligting vir 'n reeks β-CN-variante met hoë analitiese presisie, wat die monitering van die A2A2-fenotipe-frekwensie in melk wat deur hibriede koeie geproduseer word, moontlik maak. Nguyen et al. se resultate het getoon dat die fenotipiese frekwensie van A2A2-koeie konsekwent minder as 1 was, wat aandui dat geen suiwelrasse wat uitsluitlik A2-melk produseer, geïdentifiseer is nie.

Vir eindprodukte, soos vloeibare melk en melkpoeier, sluit analitiese tegnieke hoofsaaklik HPLC, kapillêre elektroforese, ELISA en proteomika in (d.w.s. analise van intakte proteïene of kenmerkende peptiede na ensiematiese vertering met behulp van metodes soos MALDI-TOF, HPLC-MS of UHPLC-Orbitrap).

(2) Gebaseer op die beginsel van analitiese metode

Kwalitatiewe analise sluit in kapillêre gelelektroforese, ELISA en MALDI-TOF.

Kapillêre gelelektroforese: Groepstandaard T/CNHFA 003-2022 Kwalitatiewe opsporing van beeskaseïenkomponente in melk en suiwelprodukte, wat beeskaseïenkomponente in beesmelk, bokmelk en hul produkte kwalitatief kan analiseer, met 'n minimum opsporingslimiet (LOD) van 1% (bestanddeelmassaverhouding).

ELISA: Bees A1β/A2β kaseïen ELISA-opsporingstel vervaardig deur Biosensis, met 'n opsporingsbereik van 6.25 ng/mL tot 400 ng/mL.

MALDI-TOF: Di Francesco L. et al. (Nutrients, 2018, 10, 1238; doi:10.3390/nu10091238) het hierdie metode gebruik om verskillende soorte melk te onderskei. Elke formule het unieke spesifisiteite. Oorskakeling van een formule na 'n ander stel spesifieke proteome bloot, wat die identifisering van vervalsing moontlik maak.

Kwantitatiewe bepaling word tipies uitgevoer met behulp van LC of LC-MS. Monstervoorbehandelingsmetodes val in drie hoofkategorieë:

Die eerste behels iso-elektriese presipitasie om CN te ekstraheer, gevolg deur die was van die presipitaat vir opsporing. Hierdie metode benodig minder reagense en lewer suiwer CN, maar is meer kompleks. Byvoorbeeld, die bogenoemde metodestandaard BJS 201915 gebruik iso-elektriese presipitasie om monsters te behandel en kan die inhoud van vier isovorme bepaal: αs1-CN, αs2-CN, β-CN en κ-CN. Verder, omdat hierdie metode gelyktydig die inhoud van verskeie CN-isovorme, insluitend β-CN, kan meet, kan dit gekombineer word met 'n A2-standaard om A2 β-CN verder te kwantifiseer.

Die tweede metode behels proteasehidrolise om kenmerkende peptiede te genereer. Hierdie metode bied akkurate kwantifisering, maar is duur. Ehling S. et al. (Journal of AOAC INTERNATIONAL, 104(6), 2021, 1559–1566) het kaseïen in melkpoeiermonsters ensiematies met tripsin gehidroliseer, 'n isotoop interne standaard bygevoeg en dit geskei met behulp van 'n Peptide BEH C18-kolom. LC-MSMS en die interne standaardmetode is gebruik om die inhoud van β-CN en A1 β-CN te bepaal. Die kwantifiseringslimiet (LOQ) vir A1 β-CN in afgeroomde melkpoeier was 0.01%. In die praktyk is hierdie metode gebruik om die inhoud van A1 β-CN in monsters gemaak van A2-melk (wat wissel van 0.26% tot 5.0%) te bepaal, en die kwaliteit van A2-suiwelprodukte is dienooreenkomstig gemonitor.

Die derde metode is gebaseer op die gebruik van reagense soos ureum, guanidienhidrochloried, ditiotreitol, natriumsitraat en dinatriumetileendiamientetraasynsuur om kaseïenmiselle te vernietig en proteïendisulfiedbindings oop te maak, waardeur die proteïen denatureer en die proteïeninhoud opspoor. Hierdie behandelingsmetode kan proteïene volledig oplos en die ruimtelike struktuur van proteïene ontvou. Dit is eenvoudig om te gebruik en tydrowend, maar die toepaslike monsterreeks is beperk. Lan Li et al. (Dairy Science and Technology, 2022, 45(2):18-23) het byvoorbeeld LC gebruik om die proteïeninhoud in ultrahoëtemperatuur-gesteriliseerde melk te bepaal. Nadat die monster vooraf behandel is met 'n bufferoplossing wat voorberei is met guanidienhidrochloried en ditiotreitol en anorganiese soute, is dit deur LC-UV geanaliseer en gekwantifiseer deur die eksterne standaardmetode. α-CN, β-CN, κ-CN, α-laktalbumien en β-laktoglobulien kan bepaal word, met 'n deteksielimiet van 0.01-0.02 g/100 mL. β-kaseïen word gevind teen 'n retensietyd van 30.0 min. Daar is drie pieke by die β-CN van gewone melk (tipe B, tipe A1, en tipe A2). Die retensietyd van A2 tipe β-CN in koeimelk is slegs A2 tipe β-CN teen 31.5 min. Hierdie metode is geskik om te identifiseer of gesteriliseerde melk A2 tipe β-CN bevat. Studies het bevind dat toetsing van rou melk en melkpoeier wat van dieselfde rou melk verwerk is, 'n verlies van 5%-10% in A2 β-CN-inhoud getoon het. Dit kan wees as gevolg van die Maillard-reaksie, wat plaasvind wanneer rou melk tydens die poeierproses verhit word. Hierdie glikosilering van tirosienresidue op die proteïen vind plaas, wat tripsin-splitsing belemmer, aangesien tirosien die splitsingsplek vir tripsin is. Die geglikosileerde CN wat deur die Maillard-reaksie geproduseer word, verskil egter van die glikoproteïene wat normaalweg deur die menslike liggaam geproduseer word en kan verminderde en veranderde fisiologiese funksies vertoon. Daarom vereis verdere bespreking of die geglikosileerde β-CN wat deur die Maillard-reaksie geproduseer word, as β-CN geklassifiseer moet word.

03 Ontwikkelingstendense en toepassingsvooruitsigte
Gegewe die wydverspreide toepassing van chromatografie en massaspektrometrietegnologie, sal die toekomstige ontwikkeling van die opsporing van A2 β-CN in suiwelprodukte op twee aspekte fokus:
(1) Metodologie. Gebaseer op proteomika, word chromatografie-massaspektrometrie hoofsaaklik gebruik om proteïene en hul samestellingsveranderinge akkuraat te identifiseer en te kwantifiseer, en dan akkuraat A2 β-CN in suiwelprodukte te kwantifiseer. Die probleme wat ondervind kan word, is: eerstens, naspeurbaarheid, want daar is tans geen kommersieel gesertifiseerde β-kaseïen of sy kenmerkende peptiedstandaardmonster of -stof (CRM) nie; tweedens, akkuraatheid. As kwantifisering deur kenmerkende peptied uitgevoer word, gebaseer op die kwantitatiewe beginsel dat een mol teikenproteïen een mol kenmerkende peptied hidroliseer, kan alkaliese tripsin nie β-CN volledig ensiematies hidroliseer nie, wat daartoe kan lei dat die deteksiewaarde laer is as die werklike waarde.
(2) Regulatoriese behoeftes. Die vasstelling van betroubare en akkurate kwalitatiewe en kwantitatiewe ontledingsmetodestandaarde en die formulering van produkstandaarde vir ooreenstemmende suiwelprodukte soos "A2-melk" of "A2-melkpoeier" sal nie net tegniese ondersteuning bied vir die toesig oor suiwelprodukte se gehalte nie, maar ook 'n handhawingsbasis vir die toesig oor voedselgehalte en -veiligheid.

Met die voortdurende verbetering van mense se vereistes vir suiwelprodukte se gehalte en die toename in markvraag, is dit nodig om doeltreffende en akkurate kwalitatiewe en kwantitatiewe analisetegnologie vir A2 β-kaseïen in suiwelprodukte te vestig en ooreenstemmende metodestandaarde en produkstandaarde te formuleer. Hierdie kan gebruik word vir egtheidsnaspeurbaarheid, kruismeng- of vervalsingsmonitering, produkformule-optimalisering en gehaltebeheer van produkte soos "A2-melk" of "A2-melkpoeier", wat nie net die regte en belange van verbruikers beskerm nie, maar ook die ekonomiese voordele van produsente beskerm.